基于肠道菌群的丹参-红花药对抗心肌缺血机制探讨
Mechanism of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Carthami Flos Drug Pairs Against Myocardial Ischemia Based on Intestinal Bacteria
王小平,杜少兵,白吉庆,周慧慧,李 菁,权利娜,王鹏飞
（陕西中医药大学药学院）
*国家自然科学基金［81974544］；陕西省重点研发计划项目［2019SF-286］；陕西省教育厅重点科学研究计划项目［18JS025］
摘要
目的：探讨丹参-红花药对抗心肌缺血的机制。方法：将60只SD雄性大鼠随机分为空白对照组（A组，等体积纯净水）、模型组（B组，等体积纯净水）、复方丹参滴丸组（C组，73mg/kg）及丹参-红花低、中、高剂量组（D1组、D2组、D3组，原药材4，8，16g/kg），各10只，各组大鼠灌胃给予相应药物或纯净水，每天1次，连续7d。于第6天、第7天灌胃给药1h后，除A组外，其余各组均皮下注射盐酸异丙肾上腺素（85mg/kg）以复制急性心肌缺血大鼠模型。观察大鼠心肌病理形态、心肌细胞凋亡情况，采用酶联免疫吸附法检测大鼠心肌酶水平；采用多指标综合指数法计算各组总效应值和偏最小二乘回归分析（PLS-DA）得分，筛选效果最佳的剂量组进行肠道菌群多样性分析。结果：D3组的综合指数最高（7.68），其次是D2组（7.18），D3组和D2组PLS-DA得分差异较小，选用D2组进行肠道菌群多样性分析；与B组比较，D2组放线菌门、TM7菌门、厚壁菌门/拟杆菌门、乳杆菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属和SMB53菌属的相对丰度显著升高（P<0.05或P<0.01），拟杆菌门、软壁菌门、脱铁杆菌门、颤螺菌属和罗斯氏菌属的相对丰度显著降低（P<0.05或P<0.01）。结论：丹参-红花药对可能通过调节肠道菌群而发挥抗心肌缺血的作用。
关键词：丹参 - 红花药对；急性心肌缺血；大鼠；盐酸异丙肾上腺素；病理形态学；心肌细胞凋亡；心肌酶；肠道菌群；16S rRNA 基因测序
Key words：Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Carthami Flos drug pairs；acute myocardial ischemia；rat；isoproterenol hydrochloride；pathomorphology；cardiomyocyte apoptosis；myocardial enzyme；intestinal bacteria；16S rRNA gene sequencing
中图分类号：R972；R285 文献标志码：A
国家心血管病中心《中国心血管健康与疾病报告2019》指出，中国现有心血管疾病患者3.30亿，其中心肌梗死约250万，且患病率持续上升，而心肌缺血是导致心血管疾病患者死亡的主要原因。丹参-红花属活血化瘀药对，疗效确切，广泛存在于具有活血化瘀功效的中成药（如丹红注射液、丹红化瘀口服液、心宁片等）中。肠道菌群与多种疾病密切相关，推测丹参-红花药对抗心肌缺血可能与肠道菌群有关。为此，本研究中采用16S rRNA基因测序技术，分析丹参-红花药对对急性心肌缺血模型大鼠肠道菌群丰度和不同分类水平的影响，探讨该药对抗心肌缺血的作用与肠道菌群调节的密切关系，为阐明其抗心肌缺血的机制奠定基础，也为缺血性心脏病的防治提供有效的药物治疗靶点。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
仪器：RM2235型切片机（徕卡显微系统<上海>有限公司）；QH01-9030A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；DP73型显微镜（奥林巴斯<北京>销售服务有限公司）；KQ-400KDE型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；EXPERT18K-R型台式高速冷冻离心机（长沙市鑫奥仪器仪表有限公司）；XSE105型分析天平（瑞士梅特勒-托利多国际股份有限公司，精度为0.01mg，0.1mg）；Nano Drop NC2000型超微量分光光度计（美国ThermoFisher公司）；BG-gds‐AUTO（130）型凝胶成像系统（北京百晶生物技术有限公司）；DYY-6C型琼脂糖电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；2720型PCR扩增仪（美国应用生物系统公司）；NovaSeq测序仪（美国Illumina公司）；FLX800T型酶标仪（美国BioTek公司）。
试药：盐酸异丙肾上腺素（ISO，美国Sigma公司，批号为P1794259）；苏木精（北京索莱宝科技有限公司，批号为H8070）；醇溶性伊红Y（批号为A600190，生工生物工程<上海>股份有限公司）；天门冬氨酸氨基转移酶（AST）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉默沙克生物技术有限公司，批号为kt22023）；肌酸激酶同工酶（CK）ELISA试剂盒（上海邦奕商贸有限公司，批号为DRE20781）；大鼠CK-MB ELISA试剂盒（上海科顺生物科技有限公司，批号为KS12296）；大鼠乳酸脱氢酶（LDH）ELISA试剂盒（武汉默沙克生物科技有限公司，批号为kt30149）；大鼠心肌肌钙蛋白I（cTnI）ELISA试剂盒（美国Burlingame公司，批号为kt30311）；琼脂糖凝胶（批号为75510-019）、琼脂糖凝胶电泳缓冲液（批号为AM9870）、NovaSeq6000SP500cyclesReagentKit（批号为20012866）、Quant-iTPicoGreendsDNAAssayKit（批号为P7589），均购自美国Invitrogen公司；Marker（日本宝生物股份有限公司，批号为DL1500/DL2000）；Q5®High-FidelityDNA聚合酶（纽英伦生物技术<北京>有限公司，批号为M0491L）；MagPureSoilDNALQKit（广州美基生物科技有限公司，批号为D6356-03）；水为纯净水。丹参及红花药材均购自河北安国药材市场，经陕西中医药大学白吉庆教授鉴定为真品。
动物：健康SPF级SD大鼠60只，雄性，体质量（200±20）g，购自成都达硕实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（川）2020-030。在温度（25±2）℃、相对湿度50%±10%条件下适应性饲养1周，期间自由饮食。动物实验通过陕西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号TCM-2018-030-E01）。
1.2 方法
1.2.1 丹参-红花药对有效物质的提取及质量控制
提取：取丹参饮片300g，红花饮片100g，加8倍量的水浸泡1h，温（45℃）浸2h，取出，放冷至室温，滤过，滤渣加8倍量水，再提取2次（每次2h），滤过，滤液合并，减压浓缩至250mL（即相当于原药材每1mL含1.6g）。实验高、中、低剂量分别为原药材1.6，0.8，0.4g/mL。
质量控制：精密吸取含原药材0.4g/mL的溶液6mL，置10mL容量瓶中，加水定容，采用高效液相色谱法测定。结果丹参素、原儿茶醛、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的质量浓度分别为0.05，0.22，0.026，0.029，0.075，0.70mg/mL。
1.2.2 分组、给药与复制模型
将60只雄性SD大鼠随机分为空白对照组（A组，等体积纯净水）、模型组（B组，等体积纯净水）、复方丹参滴丸组（C组，73mg/kg）及丹参-红花低、中、高剂量组（D1组、D2组、D3组，相当于原药材4，8，16g/kg），各10只。各组大鼠灌胃给予相应纯净水或药物，每天1次，连续7d。于第6天、第7天灌胃1h后，除A组外，其余各组大鼠皮下注射ISO（85mg/kg），选择5次心率计算ST段偏移电压的平均值，ST段向上或向下偏移超过0.1mV即为复制急性心肌缺血大鼠模型成功。
1.2.3 药效学指标检测
心肌病理形态：采用HE染色法。处死大鼠，取出心脏，固定，石蜡包埋、切片，脱蜡，以苏木素染色。采用1%盐酸酒精分化，以自来水返蓝，伊红染色，脱水，透明，封片，显微镜下观察大鼠心肌病理形态。
心肌细胞凋亡情况：采用TUNEL染色法。取出心脏，组织固定，石蜡包埋、切片，脱蜡，组织透化，过氧化氢封闭，酶标记，POD标记，DAB显色，复染，封片，显微镜下观察心肌细胞凋亡情况。
心肌酶：采用ELISA法。在末次注射ISO 12h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（5mL/kg）麻醉，腹主动脉取血，待凝固30min后常规离心，取血清。采用酶标仪检测各孔吸光度（OD）值，计算大鼠血清中AST，CK，CK-MB，LDH，cTnI活性或含量。
1.2.4 药效综合评分及效应评价
采用多指标综合指数法，对心肌细胞凋亡率、AST、LDH、CK、CK-MB、cTnI 6个指标进行标化处理，计算丹参-红花药对抗心肌缺血的总效应值。当B组指标数值高于A组时，V标化=（V模型−V给药）/V模型；当B组指标数值低于A组时，V标化=（V给药-V模型）/V模型，式中V为各指标数值。结合文献报道和临床实际检测和衡量心肌缺血的指标，确定上述6个指标的相对重要性，再利用变量投影重要性（VIP）定义各指标的权重，抗心肌缺血总效应值即为6项指标标化值乘以权重后的总和。采用Simca软件计算各指标的VIP值，依据VIP值的大小判断各个指标对总体结果的重要程度，通常VIP>1的指标贡献较大。
将所有指标的数据导入Simca-P11.5软件进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA），通过对原始数据降维处理，建立包含第1个主成分t与第2个主成分t的PLS-DA得分图，得分图的空间坐标就是各样本在第1个主成分和第2个主成分构成的平面上的投影得分值，可直观反映组间的相似或差异性，样本的坐标点在得分图上的位置越远，说明样本间的差异越明显，反之亦然。根据组间样本坐标点位置的远近，获取组间差异信息。结合综合评分和PLS-DA法的效应评价，从丹参-红花高、中、低剂量组中选取疗效最佳的一个组进行肠道菌多样性分析。
1.2.5 肠道菌群多样性分析
细菌DNA抽提：以心脏HE染色结果为依据，每组筛选3只大鼠。取大鼠盲肠内容物200mg，提取细菌总DNA，采用超微量分光光度计进行定量分析，以1.2%琼脂糖凝胶电泳检查所提取DNA的完整程度。
DNA文库构建：PCR上游引物为338F，序列为5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'，下游引物为806R，序列为5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR扩增条件，98℃预变性3min；98℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环；最终扩展延伸72℃5min。以Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit对PCR扩增产物用酶标仪进行荧光定量分析。根据结果，按样本测序量需求，按相应比例对样本进行混合。
测序：通过Illumina Novaseq-PE250测序平台进行2×250bp的双端测序获得的Paired-end（PE）reads，根据Fastq文件对测序样品进行数据质量评估，根据PEreads之间的overlap（最小overlap长度为10bp）使用FLASH（http：//www.cbcb.umd.edu/software/flash，version1.2.7）软件拼接成1条序列，对目标序列进行质控过滤［采用fastx-toolkit工具过滤数据，仅保留高质量（Q值≥25）的碱基比例≥90%的reads］，过滤后的序列与参考数据库（RDP）作比对，用usearch64-bit软件进行嵌合体序列的检测及过滤，去除已知序列的嵌合体，得到最终的优化序列。基于优化序列利用Uparse（http：//drive5.com/uparse/，version7.0.1090）进行OTU聚类分析，基于OTU聚类结果进行多样性指数分析；基于Silva（如Release132，https：//www.arb-silva.de/docu‐mentation/release-132）参考数据库，对每个样品的OTUs进行物种分类学注释，基于分类学信息进行物种结构分析和物种差异分析。
1.3 统计学处理
采用SPSS 22.0统计学软件分析。计量资料以
±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 心肌病理形态
A组大鼠心肌形态结构正常，心肌细胞排列整齐，染色均匀，细胞核染清晰，偶见心肌间质散在炎性细胞。与A组比较，B组心肌间质疏松、充血、肿胀，伴有多量炎性细胞浸润和红细胞溢出，心肌纤维断裂，心肌细胞核固缩、碎裂。与B组比较，D3组和D2组，心肌形态结构基本正常，偶见心肌间质肿胀、充血，少量炎性细胞，红细胞溢出；D1组，心肌间质肿胀、充血，伴有较多炎性细胞浸润和红细胞溢出，心肌细胞核固缩，心肌纤维断裂。详见图1。
2.2 心肌细胞凋亡情况
详见图2。B组、C组及D1组、D2组、D3组大鼠心肌细胞凋亡率分别为26.2%，12.0%，3.2%，3.5%，8.4%。
2.3 心肌酶水平
与A组比较，B组大鼠血浆LDH，CK，AST，CK-MB，cTnI水平显著升高（P<0.01）；与B组比较，C组及D1组、D2组、D3组大鼠血浆LDH，CK，AST，CK-MB，cTnI水平显著降低（P<0.01或P<0.05）。详见图3。
2.4 药效综合评分
检索到近10年心肌缺血相关文献报道1.6万篇，其中涉及心肌细胞凋亡，AST，LDH，CK，CK-MB，cTnI的数量分别为739篇、83篇、872篇、201篇、98篇、70篇；将所有指标的数据导入到Simca-P11.5软件，可得到VIP值（图4）。可见，LDH、心肌细胞凋亡率、CK指标的VIP值均大于1，表明上述指标对心肌缺血的影响相对重要；而AST，CK-MB，cTnI指标的VIP值均小于1，表明其对心肌缺血的影响相对较小。再结合各指标标准化后的数据（见表1），最终确定心肌细胞凋亡、LDH的权重系数为3，CK的权重系数为2，AST，CK-MB，cTnI的权重系数为1。
2.5 抗心肌缺血效应评价（PLS-DA法）
A组与B组PLS-DA得分有显著差异，表明建模成功；A组、C组及D1组、D2组、D3组差异较小，但两类之间有显著差异，表明C组及D2组、D3组大鼠急性心肌缺血状态得到缓解；D2组、D3组部分重叠，表明差异较小。详见图5。
2.6 肠道菌群多样性分析
Alpha多样性：指局部均匀生长环境下的物种在丰富度、多样性和均匀度等方面的指标，其通过群落多样性指数、群落均匀度指数与群落丰度指数等反映样品的物种多样性，以Chao1（Chao，1984）和Observedspe‐cies指数表征丰富度，以Shannon（Shannon，1948a，b）和Simpson（Simpson，1949）指数表征多样性，以Pielou'sevenness（Pielou，1966）指数表征均匀度。与A组比较，B组Chao1，Observedspecies，Pielou，Shannon和Simpson指数显著降低（P<0.05，P<0.01）。与B组比较，D2组Chao1，Observedspeciess，Pielou，Shannon和Simpson指数显著升高（P<0.05，P<0.01），表明丹参-红花药对可有效增加盲肠中菌群丰度、菌群多样性和均匀度。详见表2。
各组间菌群扩增子序列变异（ASVs）或可操作的分类单元（OTU）数量明显发生改变。丰度等级曲线是分析多样性的一种方式，以OTU等级为横坐标，以每个OTU中所含的序列数（log2）或者用OTU中序列数的相对百分含量为纵坐标。该曲线用于解释多样性的物种丰度和物种均匀度2个方面。在水平（横轴）方向，物种的丰度由曲线的长度来反映，物种的丰度越高，曲线在横轴上的范围越大；曲线的形状（平滑程度）反映了样本中物种的均度，曲线越平缓，物种分布越均匀，曲线越陡峭，物种间的丰度差异越大。详见图6A。D2组横轴上的折线较长，表明其OTU数量较多。详见图6B。
Beta多样性：该分析用于评估微生物群落间的差异。与A组比较，B组菌群结构组成差异明显，表明ISO诱导模型大鼠肠道菌群结构组成发生变化；而D2组偏离B组，表明丹参-红花药对可改善ISO模型大鼠肠道菌群结构组成和菌群多样性。详见图6C。
2.7 肠道菌群不同分类水平
门水平的肠道菌群组成：从各组样品中鉴定出厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、软壁菌门等16个菌门，厚壁菌门相对丰度最高，其次是拟杆菌门，厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度的比值（F/B）可在一定程度上反映机体的健康状态。详见图7。与A组比较，B组大鼠肠道菌群放线菌门、TM7门的相对丰度和F/B显著降低（P<0.05），拟杆菌门、软壁菌门、脱铁杆菌门的相对丰度显著升高（P<0.01）；与B组比较，D2组拟杆菌门、软壁菌门和脱铁杆菌门的相对丰度显著降低（P<0.01），放线菌门、TM7门的相对丰度和F/B显著升高（P<0.05），表明丹参-红花药对可调节失调的肠道菌群水平和菌群的组成，从而发挥抗心肌缺血作用。详见图8。
科、属水平的肠道菌群组成：从3组样品中共得到肠道菌在科水平、门水平排名前17位的科和属水平组成，详见图9。与A组比较，B组大鼠肠道菌群中瘤胃菌科、拟杆菌科、理研菌科和艰难杆菌科相对丰度显著升高（P<0.01）；与B组比较，D2组以上菌科相对丰度显著降低（P<0.01）。详见图10。与A组比较，B组大鼠肠道菌群中颤螺菌属和罗斯氏菌属相对丰度显著升高（P<0.05），乳杆菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属和SMB53属相对丰度显著降低（P<0.05）；与B组比较，D2组颤螺菌属和罗斯氏菌属相对丰度显著降低（P<0.05），乳杆菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属和SMB53菌属相对丰度显著升高（P<0.05）。表明丹参-红花药对可显著调节急性心肌缺血模型大鼠肠道菌群。详见图11。
3 讨论
本研究中以心肌病理、心肌细胞凋亡及心肌酶等指标，采用多指标综合指数法，计算总效应值，评价高、厚壁菌门是肠道菌群的主要组成部分，其主要代谢产物为包括乙酸、丙酸和丁酸等在内的短链脂肪酸，而短中、低剂量丹参-红花药对对模型大鼠心肌缺血的保护作用，结果可知，D3组>D2组>C组>D1组，由PLS-DA得分图可知，D2组和D3组部分重叠，说明差异较小，故选取D2组进行肠道菌多样性分析。结果表明，丹参-红花药对可显著改善急性心肌缺血模型大鼠肠道中颤螺菌属、罗斯氏菌、乳杆菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属和SMB53菌属的相对丰度，其抗心肌缺血作用可能是通过调节上述菌群实现的。
本研究结果表明，丹参-红花药对可一定程度上调节门分类水平菌群，主要集中在厚壁菌门和拟杆菌门，显著升高厚壁菌门的相对丰度和F/B（P<0.01），链脂肪酸可诱导T细胞分化成调节性T细胞，保护心肌缺血，说明丹参-红花药对可能通过升高厚壁菌门的相对丰度和F/B改变肠道菌群的组成，促进T细胞分化成调节性T细胞而达到保护模型大鼠心肌缺血的目的。
在属水平，心肌缺血模型大鼠的乳杆菌属相对丰度水平显著降低，罗斯氏菌属相对丰度水平显著升高，与已有文献结论一致。丹参-红花药对能升高心肌缺血模型大鼠肠道中乳杆菌属相对丰度、SMB53菌属、棒状杆菌属和葡萄球菌属相对丰度，其中乳杆菌是维持肠道菌群平衡和健康的有益菌，可改善心肌梗死后的心脏重塑，还可通过谷氨酸脱羧合成γ-氨基丁酸，抑制促炎性细胞因子减轻炎性反应，起到心肌保护作用。此外，乳杆菌等益生菌可上调心肌缺血模型大鼠神经递质5-羟色胺和多巴胺的水平，说明丹参-红花药对可能通过回调急性心肌缺血模型大鼠肠道益生菌的相对丰度来改善心肌缺血。
有研究表明，肠道菌群可通过参与色氨酸的代谢来影响CVD的发生与发展。大肠杆菌和乳杆菌等细菌中的色氨酸酶能将色氨酸转化为吲哚和吲哚-3-乙酸（IAA）等，IAA可减少炎性介质的产生，同时调节胆固醇和胆汁酸生物合成，减轻炎性反应，而丹参-红花药对可升高急性心肌缺血模型大鼠肠道中乳杆菌属相对丰度，说明丹参-红花药对可能是通过升高乳杆菌属的相对丰度，促进IAA的生成，减轻炎性反应，从而发挥保护心肌缺血的作用。
综上所述，丹参-红花药对的抗心肌缺血作用可能与调节性T细胞分化增殖、色氨酸代谢途径、抗炎作用有关，也可能与参与上述作用的相关菌群有关。本课题组后续将通过分子生物学方法对差异菌群和调节性T细胞的分化增殖、色氨酸代谢途径等可验证途径进行验证。本研究有助于探讨丹参-红花药对抗心肌缺血的作用机制，为其临床应用提供理论依据。
参考文献：略。
作者简介：
第一作者：王小平，女，博士，教授，研究方向为中药药效物质基础研究。
该文完整发布于《中国药业》杂志2022年4月20日出版的第31卷第8期第30~36页。
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