目的：探讨银翘散对急性肺损伤（ALI）模型小鼠肺损伤的改善及作用机制。方法：将60只KM小鼠随机分为阴性对照组、模型组、银翘散组、脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）组，各15只。银翘散组灌胃给予银翘散（按生药和体质量计72.54g/kg），阴性对照组、模型组、DnaseⅠ组小鼠均灌胃给予等体积生理盐水，每天1次，连续3 d。末次给药30 min后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，剥离皮下组织，暴露气管，于气管内滴注脂多糖（5 mg/kg），阴性对照组同法滴注生理盐水，以复制ALI模型小鼠；DNaseⅠ组建模成功10min后同法滴注DNaseⅠ（5mg/kg）。6h后处死小鼠，取出肺组织，测定肺部湿/干重比（W/D）；采用免疫荧光法和蛋白免疫印迹法检测髓过氧化物酶（MPO）和瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）的表达水平；苏木精-伊红（HE）染色，观察肺组织的病理形态。结果：与模型组比较，银翘散组W/D显著降低（P<0.05），MPO和CitH3的表达水平均显著降低（P<0.05），气道周围及肺组织中的炎性细胞浸润减轻。结论：银翘散可通过抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成中MPO和CitH3的表达水平，从而减轻小鼠ALI。

关键词：银翘散；中性粒细胞胞外诱捕网；急性肺损伤；作用机制；小鼠

Key words： Yinqiao Powder；neutrophil extracellular traps；acute lung injury；mechanism；mice

中图分类号：R932;R285.5  文献标志码：A

1.1  仪器、试药与动物

仪器：XS125A型分析天平（瑞士普利赛斯公司，精度为十万分之一）；Infinite M200 PRO型酶标仪（瑞士Tecan公司）；cf16RX型低温高速离心机（日本HitachiKoki公司）；OSE-Y50型高速组织研磨器（天根生化科技<北京>有限公司）；Ti-S型倒置相差显微镜、Ci-L型正置荧光显微镜（日本Nikon公司）；EG1150型石蜡包埋机、RM2235型手动轮转式切片机（德国徕卡仪器有限公司）。

试药：银翘散组方药材购自云南慈慧药业有限公司，制备工艺参考文献；脂多糖（美国Sigma公司，货号为O111：B4，批号为019M4009V）；兔来源抗CitH3抗体（批号为GR-13294584），兔来源抗MPO抗体（批号为GR3243222-17），均购自英国Abcam公司；DAPI染料（批号为20200630），驴血清（批号为20200818），DN‐aseI（批号为20200630），均购自北京索莱宝科技有限公司；异硫氰酸荧光素（FITC）山羊抗兔荧光抗体（批号为20000168），四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）山羊抗兔荧光抗体（批号为20000054），辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（批号为20000243），抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（批号为00083126），均购自美国ProteintechGroup公司。

动物：健康雄性KM小鼠，60只，体质量17～20g，购自成都达硕实验动物有限公司，动物生产许可证号为SYXK（川）K2020-030，合格证号为51203500017366。饲养环境为温度18～22℃，相对湿度40%～60%，明暗交替（12h/12h）。动物实验经云南中医药大学动物实验伦理委员会批准，动物伦理审查编号为R-06202009。

1.2  方法

分组、造模与给药：按随机数字表法将60只KM小鼠分为阴性对照组、模型组、银翘散组、DNaseⅠ组，各15只。银翘散组小鼠灌胃给予银翘散（按生药和体质量计72.54g/kg），阴性对照组、模型组、DNaseⅠ组小鼠均灌胃给予等体积生理盐水，每天1次，连续3 d。造模前均禁食不禁饮8 h。末次给药30 min后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，仰卧位固定于手术板上，颈部皮肤消毒，纵向切开，剥离皮下组织，暴露气管，于气管内滴注脂多糖生理盐水溶液（5mg/kg），阴性对照组同法滴注等体积生理盐水。随后立即直立小鼠，上下轻度晃动数次，使脂多糖均匀分布于肺部，DNaseⅠ组小鼠滴注脂多糖10min后再同法滴注DNaseⅠ（5mg/kg），缝合伤口，待小鼠自然清醒。

指标观察及检测：1）肺湿/干重比（W/D）。模型复制6h后处死小鼠，无菌条件下迅速取出肺组织。取左肺上叶，准确称定质量并记录湿重（W），放入恒温80℃干燥箱中烘烤72h，称定质量，并记录干重（D），计算W/D。2）肺组织形态。取右肺中叶，用10%多聚甲醛固定48h，脱水，浸蜡，石蜡包埋，制成4µm薄片，用苏木精-伊红（HE）染色，于显微镜下观察。3）MPO和CitH3的表达水平。取右肺上叶，采用蛋白免疫印迹法检测MPO和CitH3的表达水平；取左肺中叶，采用免疫荧光法检测MPO和CitH3的荧光表达水平。

1.3  统计学处理

采用SPSS10.0统计学软件分析。计数资料用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用Tamhane's法。P<0.05为差异有统计学意义。

2.1  肺组织W/D

与阴性对照组比较，模型组小鼠肺组织W/D显著升高（P<0.05）；与模型组比较，银翘散组W/D显著降低（P<0.05）。详见表1。

2.2  肺组织病理形态学变化

阴性对照组小鼠肺泡结构完整，支气管和血管周围未见明显炎性变化；模型组小鼠肺毛细血管通透性增高，肺部水肿，肺组织间隙可见大量中性粒细胞浸润和红细胞渗出；银翘散组和DNaseⅠ组小鼠肺组织病变均较模型组减轻，气道周围及肺组织炎性细胞浸润减轻。详见图1。

2.3  肺组织中MPO和CitH3免疫荧光表达

与阴性对照组比较，模型组小鼠MPO和CitH3的荧光表达水平均升高；与模型组比较，银翘散组小鼠MPO和CitH3的荧光表达水平均下降。详见图2。

2.4  肺组织中MPO和CitH3的蛋白表达水平

与阴性对照组比较，模型组小鼠肺组织中MPO和CitH3表达水平均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，银翘散组小鼠肺组织中MPO和CitH3表达水平均显著降低（P<0.05）。详见图3。

ALI是由多种诱因引起的以急性、进行性呼吸功能不全为特点的常见临床危重症，严重时表现为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。ALI/ARDS由直接或间接的过度肺部损伤和全身性炎性反应引起，其中NETs发挥了重要作用。新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的呼吸道疾病，可能发展为ARDS。COVID-19感染患者气道腔内的NETs，促进血纤蛋白沉积和微血栓形成，阻塞肺泡和细小血管，导致气管堵塞和肺通气障碍。COVID-19严重感染患者的肺中存在多个广泛分布的NETs浸润区域，NETs通过促进纤维细胞的分化，从而加重肺部纤维化。中性粒细胞形成NETs，可增强其直接杀灭或间接干扰病原体扩散的作用，阻止上呼吸道感染的进一步发展。但过度激活的中性粒细胞在肺部形成大量的NETs，会直接加剧肺组织的损伤，推动呼吸道感染的恶化进程。

CitH3的生成可反映NETs水平。组蛋白瓜氨酸化后，核小体中组蛋白和DNA间的紧密静电结合被削弱，随后DNA骨架解螺旋，NETs形成。而组蛋白在体内外均可对上皮细胞产生细胞毒性作用，加重ALI症状。MPO可导致体外肺上皮和内皮细胞死亡，表明MPO对肺泡-毛细血管屏障有直接毒性作用，其表达也可反映NETs水平。本研究中模型组小鼠肺组织中NETs水平较高，且肺组织炎性细胞浸润严重，可能是NETs中MPO与CitH3等对肺组织的损伤造成的。中医认为，ALI主要由肺部损伤以致肺失宣降、郁热内生，影响水液的输布和排泄导致。银翘散主要由金银花、连翘、桔梗、甘草、薄荷、牛蒡子等组方，具有疏散风热、辛凉宣散、清热解毒、开宣肺气、止咳等功效。本研究结果显示，银翘散可缓解ALI模型小鼠肺部炎症的渗出和水肿，且小鼠肺组织中NETs形成相关蛋白MPO和CitH3表达水平均降低，提示银翘散可能通过抑制NETs的形成而减轻ALI，但其具体作用机制还需进一步研究。